適度地保存定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到了細(xì)胞保種的作用。除此之外，還可以利用細(xì)胞凍存的形式來購(gòu)買、寄贈(zèng)、交換和運(yùn)送某些細(xì)胞。天的技術(shù)文章中就為大家講解下細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇操作方法！

操作步驟

（）細(xì)胞凍存

1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液；

2. 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰蛋白酶把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至15ml離心管中；

3. 離心1000rpm，5min；

4. 去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的終密度為5×106/ml～1×107/ml；

5. 將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml；

6. 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者；

7. 凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

（二）細(xì)胞復(fù)蘇

1.將冷凍管從液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化，細(xì)胞融化后要盡快(約1min)移出37℃水浴。37℃水浴時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)提高細(xì)胞死亡率，復(fù)蘇過程中般細(xì)胞死亡率在20%～25%之間。

2.迅速用酒精棉球擦拭冷凍管外部殺菌消毒，然后放置在冰浴上。

3.小心開啟瓶蓋，把細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有4mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，然后把培養(yǎng)瓶移至培養(yǎng)箱，26℃～28℃培養(yǎng)1h，讓細(xì)胞貼壁。

4.細(xì)胞貼壁后，小心移棄培養(yǎng)基，主要是去掉DMSO(懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞要通過離心沉淀除去DMSO)、死細(xì)胞及其碎片，加5mL新鮮培養(yǎng)基，26℃～28℃培養(yǎng)。

5.細(xì)胞培養(yǎng)24h后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)直到形成單層，便可以傳代。

6.詳細(xì)記錄復(fù)蘇細(xì)胞的名稱、數(shù)量、復(fù)蘇時(shí)間、存放部位等。

注意事項(xiàng)

1．從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，但好為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。在凍存天好換次培養(yǎng)液；

2．將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護(hù)工作，以免凍傷；

3．凍存和復(fù)蘇好用新配制的培養(yǎng)液。

原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司