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技術(shù)文章

你們了解雙抗夾心ELISA法嗎?

點擊次數(shù):14438   發(fā)布時間:2022/10/10 9:55:52

  雙抗夾心ELISA法是指講特異性針對代測抗原的抗體包被于96孔微孔板中,制成固體載體,向微孔中分別加入標準品或標本,其中代測抗原連接于固相載體的抗體結(jié)合,然后加入生物素化的針對代測抗原的抗體,形成夾心,將未結(jié)合的生物素化抗體洗凈后,加入HRP標記的親和素,再次徹底洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下,轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測抗體原正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(O.D.值),用于樣本中待測抗原濃度測算。
 
1.材料與儀器
(1) 包被緩沖液 (pH 9.6 0.05 M 碳酸鹽緩沖液)
(2)洗滌緩沖液 (pH 7.4,0.15 M PBS)
(3)稀釋液
(4)終止液(2 M H2SO4)
(5)底物緩沖液 (pH 5.0)
(6)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)使用液
(7)2,2’-連氮基-雙-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺(ABTS)使用液
(8)抗原、抗體和酶標記抗體:按說明書處理。
(9)標準品:用稀釋液稀釋成梯度濃度溶液。
(10)96 孔聚苯乙烯塑料板 (酶標板)。
 
2.步驟
⑴將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體:洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
 
⑵加受檢標本:使之與固相抗體接觸反應一段時間,讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合,形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
 
⑶加酶標抗體:使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
 
⑷加底物:夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
 
根據(jù)同樣原理,將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結(jié)合物,即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。

 

原創(chuàng)作者:上海恒遠生物技術(shù)發(fā)展有限公司

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